色譜柱可分為填充柱和開管柱兩大類。多為金屬或玻璃制作。有直管形、盤管形、U形管等形狀。液相色譜通常均采用填充柱。

色譜柱的分離效果取決于所選擇的固定相，以及色譜柱的制備和操作條件。

色譜是一種分離分析手段，分離是核心，因此擔負分離作用的色譜柱是色譜系統(tǒng)的心臟。對色譜柱的要求是柱效高、選擇性好，分析速度快等。市售的用于HPLC的各種微粒填料如多孔硅膠以及以硅膠為基質(zhì)的鍵合相、氧化鋁、有機聚合物微球（包括離子交換樹脂）、多孔碳等，其粒度一般為3,5,7,10μm等，柱效理論值可達5~16萬/米。對于一般的分析只需5000塔板數(shù)的柱效；對于同系物分析，只要500即可；對于較難分離物質(zhì)對則可采用高達2萬的柱子，因此一般10~30cm左右的柱長就能滿足復(fù)雜混合物分析的需要。

柱效受柱內(nèi)外因素影響，為使色譜柱達到最佳效率，除柱外死體積要小外，還要有合理的柱結(jié)構(gòu)（盡可能減少填充床以外的死體積）及裝填技術(shù)。即使最好的裝填技術(shù)，在柱中心部位和沿管壁部位的填充情況總是不一樣的，靠近管壁的部位比較疏松，易產(chǎn)生溝流，流速較快，影響沖洗劑的流形，使譜帶加寬，這就是管壁效應(yīng)。這種管壁區(qū)大約是從管壁向內(nèi)算起30倍粒徑的厚度。在一般的液相色譜系統(tǒng)中，柱外效應(yīng)對柱效的影響遠遠大于管壁效應(yīng)。

色譜柱由柱管、壓帽、卡套（密封環(huán)）、篩板（濾片）、接頭、螺絲等組成。柱管多用不銹鋼制成，壓力不高于70 kg/cm² 時，也可采用厚壁玻璃或石英管，管內(nèi)壁要求有很高的光潔度。為提高柱效，減小管壁效應(yīng)，不銹鋼柱內(nèi)壁多經(jīng)過拋光。也有人在不銹鋼柱內(nèi)壁涂敷氟塑料以提高內(nèi)壁的光潔度，其效果與拋光相同。還有使用熔融硅或玻璃襯里的，用于細管柱。色譜柱兩端的柱接頭內(nèi)裝有篩板，是燒結(jié)不銹鋼或鈦合金，孔徑0.2~20μm（5~10&μm），取決于填料粒度，目的是防止填料漏出。

色譜柱按用途可分為分析型和制備型兩類，尺寸規(guī)格也不同：

①常規(guī)分析柱（常量柱），內(nèi)徑2~5mm（常用4.6mm，國內(nèi)有4mm和5mm），柱長10~30cm；

②窄徑柱（narrow bore，又稱細管徑柱、半微柱semi-microcolumn），內(nèi)徑1~2mm，柱長10~20cm；

③毛細管柱（又稱微柱microcolumn），內(nèi)徑0.2~0.5mm；

④半制備柱，內(nèi)徑>5mm；

⑤實驗室制備柱，內(nèi)徑20~40mm，柱長10~30cm；

⑥生產(chǎn)制備柱內(nèi)徑可達幾十厘米。柱內(nèi)徑一般是根據(jù)柱長、填料粒徑和折合流速來確定，目的是為了避免管壁效應(yīng)。

常見的分配柱填料：碳十八柱 ^[1]（ODS/C18)、碳八柱（MOS/C8）、碳六柱（Hexyl/C6）、碳四柱（Butyl/C4）、碳一柱（Methyl/C1）、陰離子交換柱（SAX)、陽離子交換柱（SCX）、苯基柱（Phenyl）、氨基柱（Amino/NH2）、氰基柱（Cyano/CN/Nitrile）

常見的吸附柱填料：硅膠柱

1、首先應(yīng)確認柱和儀器的接頭以及管路是否匹配。為減少死體積，進樣閥、柱子、檢測器之間的連接管路內(nèi)徑盡可能使用內(nèi)徑較小的管線，同時控制進樣器、色譜柱和檢測器之間連接管線的長度。安裝色譜柱之前，確認流路系統(tǒng)中的溶劑是否正常。對分析較復(fù)雜的樣品建議安裝保護柱。

2、為了使色譜柱與儀器系統(tǒng)達最佳的連接效果，應(yīng)盡量使用與色譜柱接口相匹配的螺帽和錐形接頭，如原來的接頭長期匹配其他類型的色譜柱，建議在連接新色譜柱前應(yīng)檢查匹配情況，避免造成色譜柱的損壞或因色譜柱不匹配造成的漏液。

3、使用PEEK 材料的通用接頭，只需用手擰緊不需要特定扳手，使用壓力為5000psi；使用溫度不得超過100℃。

1、在進行樣品檢測前，至少使用20倍柱體積流動相使色譜柱充分平衡。流動相一定要使用色譜級別的溶劑。如使用水相的緩沖液應(yīng)當天配制以保持新鮮避免細菌產(chǎn)生。

2、流動相使用前需用微孔濾膜過濾,消除流動相中顆粒對色譜系統(tǒng)和色譜柱的損壞。緩沖液與其他流動相混合后應(yīng)重新過濾避免溶解度變化造成產(chǎn)生新的沉淀。不應(yīng)使用純水作為流動相沖洗C18色譜柱，以免柱性能損壞（添加5%的有機溶劑沖洗色譜柱，同時可以達到對緩沖鹽清洗的作用。還可以使色譜柱更容易平衡）。

3、流動相需脫氣后使用，可避免因氣泡導(dǎo)致的泵和檢測器的工作不正常。如果測試時使用的流動相與色譜柱保存使用的流動相有較大區(qū)別，應(yīng)該使用過度分布的形式進行平衡。避免由于流動相的突然變化造成柱壓增加過大或流動相緩沖鹽結(jié)晶造成對色譜柱和儀器系統(tǒng)的損壞。正相色譜柱比反相色譜柱需要更長的平衡時間。

1、樣品應(yīng)當盡可能溶解在能與流動相相互溶的溶劑中。除特殊指明外，如使用強溶劑溶解樣品柱子的分辨率將可能降低。

2、樣品溶液在進樣前應(yīng)使用針頭式過濾器對樣品預(yù)先過濾。頻繁改變流動相組成，會加速降低柱效。

3、色譜柱由高壓勻漿法裝填，能承受較高壓力。為獲得最佳分離效果，使用時請不要超過200kgf，而且避免壓力突然上升或變化，否則會造成硅膠填料的破壞，減少色譜柱的使用壽命。除特殊要求外最高操作溫度不要超過60℃。

1、如果流動相含有酸或無機鹽，應(yīng)當先用去離子水（20倍柱體積）沖洗干凈。然后用用100%乙腈或甲醇保存色譜柱。最后用柱子的接頭密封，并放在穩(wěn)定的環(huán)境中存放。

2、應(yīng)避免色譜柱受到直接的機械沖擊或摔落，避免造成色譜柱性能的降低。

用相當于20倍柱體積的溶劑按下列順序沖洗柱子，建議按柱子的箭頭方向沖洗，盡可能不反沖。沖洗時使用的的參考溶劑順序是水、甲醇、氯仿、異丙醇。

色譜柱的性能除了與固定相性能有關(guān)外，還與填充技術(shù)有關(guān)。在正常條件下，填料粒度>20μm時，干法填充制備柱較為合適；顆粒<20μm時，濕法填充較為理想。填充方法一般有4種：①高壓勻漿法，多用于分析柱和小規(guī)模制備柱的填充；②徑向加壓法，Waters專利；③軸向加壓法，主要用于裝填大直徑柱；④干法。柱填充的技術(shù)性很強，大多數(shù)實驗室使用已填充好的商品柱。

必須指出，高效液相色譜柱的獲得，裝填技術(shù)是重要環(huán)節(jié)，但根本問題還在于填料本身性能的優(yōu)劣，以及配套的色譜儀系統(tǒng)的的結(jié)構(gòu)是否合理。

無論是自己裝填的還是購買的色譜柱，使用前都要對其性能進行考察，使用期間或放置一段時間后也要重新檢查。柱性能指標包括在一定實驗條件下（樣品、流動相、流速、溫度）下的柱壓、理論塔板高度和塔板數(shù)、對稱因子、容量因子和選擇性因子的重復(fù)性，或分離度。一般說來容量因子和選擇性因子的重復(fù)性在±5%或±10%以內(nèi)。進行柱效比較時，還要注意柱外效應(yīng)是否有變化。

一份合格的色譜柱評價報告應(yīng)給出柱的基本參數(shù)，如柱長、內(nèi)徑、填料的種類、粒度、色譜柱的柱效、不對稱度和柱壓降等。

色譜柱的正確使用和維護十分重要，稍有不慎就會降低柱效、縮短使用壽命甚至損壞。在色譜操作過程中，需要注意下列問題，以維護色譜柱。 ^[2] 

①　避免壓力和溫度的急劇變化及任何機械震動。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會影響柱內(nèi)的填充狀況；柱壓的突然升高或降低也會沖動柱內(nèi)填料，因此在調(diào)節(jié)流速時應(yīng)該緩慢進行，在閥進樣時閥的轉(zhuǎn)動不能過緩（如前所述）。

②　應(yīng)逐漸改變?nèi)軇┑慕M成，特別是反相色譜中，不應(yīng)直接從有機溶劑改變?yōu)槿渴撬?，反之亦然?

③　一般說來色譜柱不能反沖，只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖時，才可以反沖除去留在柱頭的雜質(zhì)。否則反沖會迅速降低柱效。

④　選擇使用適宜的流動相（尤其是pH），以避免固定相被破壞。有時可以在進樣器前面連接一預(yù)柱，分析柱是鍵合硅膠時，預(yù)柱為硅膠，可使流動相在進入分析柱之前預(yù)先被硅膠“飽和”，避免分析柱中的硅膠基質(zhì)被溶解。

⑤　避免將基質(zhì)復(fù)雜的樣品尤其是生物樣品直接注入柱內(nèi)，需要對樣品進行預(yù)處理或者在進樣器和色譜柱之間連接一保護柱。保護柱一般是填有相似固定相的短柱。保護柱可以而且應(yīng)該經(jīng)常更換。

⑥　經(jīng)常用強溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內(nèi)的雜質(zhì)。在進行清洗時，對流路系統(tǒng)中流動相的置換應(yīng)以相混溶的溶劑逐漸過渡，每種流動相的體積應(yīng)是柱體積的20倍左右，即常規(guī)分析需要50~75ml。

下面列舉一些色譜柱的清洗溶劑及順序，作為參考：硅膠柱以正已烷（或庚烷）、二氯甲烷和甲醇依次沖洗，然后再以相反順序依次沖洗，所有溶劑都必須嚴格脫水。甲醇能洗去殘留的強極性雜質(zhì)，已烷使硅膠表面重新活化。反相柱以水、甲醇、乙腈、一氯甲烷（或氯仿）依次沖洗，再以相反順序依次沖洗。如果下一步分析用的流動相不含緩沖液，那么可以省略最后用水沖洗這一步。一氯甲烷能洗去殘留的非極性雜質(zhì)，在甲醇（乙腈）沖洗時重復(fù)注射100~200μl四氫呋喃數(shù)次有助于除去強疏水性雜質(zhì)。四氫呋喃與乙腈或甲醇的混合溶液能除去類脂。有時也注射二甲亞砜數(shù)次。此外，用乙腈、丙酮和三氟醋酸（0.1%）梯度洗脫能除去蛋白質(zhì)污染。

陽離子交換柱可用稀酸緩沖液沖洗，陰離子交換柱可用稀堿緩沖液沖洗，除去交換性能強的鹽，然后用水、甲醇、二氯甲烷（除去吸附在固定相表面的有機物）、甲醇、水依次沖洗。

⑦　保存色譜柱時應(yīng)將柱內(nèi)充滿乙腈或甲醇，柱接頭要擰緊，防止溶劑揮發(fā)干燥。絕對禁止將緩沖溶液留在柱內(nèi)靜置過夜或更長時間。

⑧　色譜柱使用過程中，如果壓力升高，一種可能是燒結(jié)濾片被堵塞，這時應(yīng)更換濾片或?qū)⑵淙〕鲞M行清洗；另一種可能是大分子進入柱內(nèi)，使柱頭被污染；如果柱效降低或色譜峰變形，則可能柱頭出現(xiàn)塌陷，死體積增大。

在后兩種情況發(fā)生時，小心擰開柱接頭，用潔凈小鋼將柱頭填料取出1~2mm高度（注意把被污染填料取凈）再把柱內(nèi)填料整平。然后用適當溶劑濕潤的固定相（與柱內(nèi)相同）填滿色譜柱，壓平，再擰緊柱接頭。這樣處理后柱效能得到改善，但是很難恢復(fù)到新柱的水平。

柱子失效通常是柱端部分，在分析柱前裝一根與分析柱相同固定相的短柱（5~30mm），可以起到保護、延長柱壽命的作用。采用保護柱會損失一定的柱效，這是值得的。

通常色譜柱壽命在正確使用時可達2年以上。以硅膠為基質(zhì)的填料，只能在pH2~9范圍內(nèi)使用。柱子使用一段時間后，可能有一些吸附作用強的物質(zhì)保留于柱頂，特別是一些有色物質(zhì)更易看清被吸著在柱頂?shù)奶盍仙?。新的色譜柱在使用一段時間后柱頂填料可能塌陷，使柱效下降，這時也可補加填料使柱效恢復(fù)。

每次工作完后，最好用洗脫能力強的洗脫液沖洗，例如ODS柱宜用甲醇沖洗至基線平衡。當采用鹽緩沖溶液作流動相時，使用完后應(yīng)用無鹽流動相沖洗。含鹵族元素（氟、氯、溴）的化合物可能會腐蝕不銹鋼管道，不宜長期與之接觸。裝在HPLC儀上柱子如不經(jīng)常使用，應(yīng)每隔4~5天開機沖洗15分鐘。

1、石墨化碳填料

硅膠的化學(xué)穩(wěn)定性較差，僅能在pH=2~8的環(huán)境下工作。但是，在很多場合下，需要使用極端的pH條件。為此，人們曾大力發(fā)展高分子微球、氧化鋁、氧化鋯等化學(xué)穩(wěn)定性更好的基質(zhì)材料。但是，很難有一種材料能全面地滿足液相色譜基質(zhì)的要求。例如，高分子微球在有機溶劑中會發(fā)生一些溶脹，因此難以應(yīng)用于以含有機溶劑的流動相進行梯度淋洗的場合；氧化鋁和氧化鋯與硅膠相比，雖然化學(xué)穩(wěn)定性較好，但其表面修飾與鍵合比較困難。因此，化學(xué)穩(wěn)定性好的碳材料便很自然地被考慮作為色譜填料的基質(zhì)。

碳材料有極好的化學(xué)穩(wěn)定性，可耐受寬達pH=1~14的環(huán)境；耐高溫，石墨化碳可耐3000℃以上的高溫而不受破壞；經(jīng)適當加工的碳材料可具有很好的機械強度，具有優(yōu)良的導(dǎo)電性、導(dǎo)熱性及電磁屏蔽特性。更為難能可貴的是，多孔性碳材料以其結(jié)構(gòu)的特點而具有很好的吸附性及選擇性。正是碳材料的這些特性，使人們期待它在色譜領(lǐng)域中能有特殊的用途。

2、貫流色譜填料

貫流色譜是20世紀80年代末至90年代初發(fā)展起來的一種色譜分離新方法。在這種填料上，既有通常的微孔或大孔，例如50~150nm的微孔，又有貫穿整個顆粒的，孔徑約600~800nm超大孔存在。這種貫穿的大孔，可以允許流動相直接進入填料顆粒的內(nèi)部并貫穿而過。這樣，就相當于極大地降低了填料顆粒的直徑，即以貫穿孔將填料分割成了很多更細小的顆粒，在這種小顆粒上的微孔已經(jīng)短到不對傳質(zhì)過程構(gòu)成明顯的阻力。因此，在這種貫流色譜填料上，傳質(zhì)阻力已經(jīng)非常小。同時，貫穿孔內(nèi)流動相的線速度正比于柱子中流動相的速度，即傳質(zhì)過程已由擴散傳質(zhì)變?yōu)閷α鱾髻|(zhì)。這就意味著，在一定范圍內(nèi)，及時提高流動相速度，也不會降低柱子的分離效率。由于填料上同時還存在有通常的多孔結(jié)構(gòu)，其比表面積并未隨貫穿孔的出現(xiàn)而大幅度降低。

因此，在這種填料上的樣品負載量也不隨流速的增加而減少。再者，填料上600~800nm的貫穿孔，極大地增加了柱子的通透性，使得這種柱子即使工作于很高的流速下，其操作壓力也不需要很高。所以，這種貫流色譜柱可以同時具有高流速、高效率、高樣品負載量和低操作壓力的特點。

3、整體柱

整體柱又稱整體固定相、棒柱、連續(xù)床等，是在柱管內(nèi)原位聚合或固定化了的連續(xù)整體多孔結(jié)構(gòu)，可根據(jù)需要對整體材料的表面作相應(yīng)的衍生化，是一種新型的用于分離分析或作為反應(yīng)器的多孔介質(zhì)。通過控制聚合條件來得到具有理想孔徑分布的整體柱。整體柱中的空間由聚合物顆粒中的孔和顆粒間的縫隙組成，分離在樣品流經(jīng)孔結(jié)構(gòu)時發(fā)生?？梢詼p少路徑的差異和縱向擴展。

整體柱的優(yōu)點包括：可以原位制備，省去制備填料和裝柱，也可以同法制成聚合物顆粒后再裝柱；聚合物易于制備，柱子的長度和直徑在一定程度上不受限制；聚合反應(yīng)混合物中的單體可以靈活選擇以得到適合的基質(zhì)和性質(zhì)；易于在柱衍生化，以得到具有合適性質(zhì)的色譜柱；通過控制聚合反應(yīng)的條件可以優(yōu)化孔的性狀。